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血清HBV RNA在HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者中的检测价值

来源:中华肝脏病杂志 日期:2019-10-26 14:58;作者:蒋贝 等    

  文章来源:中华肝脏病杂志2019,27(9):668-672
 
  作者:蒋贝 刘畅 苏瑞 孟超 曹宇 郑晓雅 任文娟 吕菲楠 陆伟
 
  摘要
 
  目的
 
  分析经恩替卡韦治疗后血清HBV DNA已降至"检测值下限"的慢性乙型肝炎患者中血清HBV RNA的水平,并探究HBV RNA水平与患者肝脏生物化学指标之间的相关性。以期为新型血清学标志物HBV RNA的临床意义奠定研究基础。
 
  方法
 
  纳入接受规范的核苷类药物抗病毒治疗12个月以上,HBeAg发生阴转,且连续6个月血清HBV DNA检测结果均为低于检测下限的慢性乙型肝炎患者107例。采用PerkinElmer公司的研发试剂检测血清中HBV RNA水平,采用罗氏Cobas检测血清中HBV DNA水平,使用HITACHI全自动生物化学分析仪检测丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶,使用ARCHITECT化学发光分析仪检测HBsAg、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc。用R Studio软件对HBV RNA水平与患者肝脏生物化学指标之间的相关性进行分析;采用Logistic回归分析影响HBV RNA水平的独立影响因素。
 
  结果
 
  经恩替卡韦治疗后血清HBV DNA已降至低于检测下限的慢性乙型肝炎患者中血清HBV RNA的阳性检出率为22.43%。HBV RNA阳性组患者中HBsAg、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶水平略高于HBV RNA阴性组;抗-HBc在HBV RNA阴性组中水平略高。抗-HBe在HBV RNA阴性组和阳性组中水平差异无统计学意义。经Logistic回归分析结果显示抗-HBc是影响HBV RNA检测水平的独立影响因素(P = 0.021)。
 
  结论
 
  经恩替卡韦治疗后血清HBV DNA已降至低于检测下限的慢性乙型肝炎患者中仍有部分患者可检出HBV RNA,而血清HBV RNA仅来源于cccDNA的直接转录,故比HBV DNA和HBsAg更能反映cccDNA水平或者活性。抗-HBc作为影响HBV RNA水平的独立影响因素,有可能联合使用作为预测抗病毒疗效的新指标。
 
  慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)是影响我国全民健康的重大传染性疾病[1]。规范的抗病毒治疗能够有效延缓肝脏疾病的进程,减少肝硬化、肝癌的发生,目前HBV DNA病毒载量检测是唯一被许可的实验室指标,用于监测外周血循环病毒颗粒数量,从而反映了肝脏内病毒产生的活动性[2]。然而,在目前强效核苷及核苷酸类药物抗病毒治疗时代,绝大部分CHB患者血清HBV DNA水平低于检测下限,但血清HBV DNA消失仅代表了病毒的逆转录过程被有效抑制,并不能真实反映肝细胞内共价闭合环状DNA(cccDNA)的存在性和转录活性。此外,随着核苷类药物长期治疗,部分患者肝组织内cccDNA接近耗竭或者转录沉默,但是因为存在HBV DNA整合片段,血清HBeAg很难转阴[3]。肝组织内检测不到cccDNA是HBV感染彻底治愈的一项重要指标[4],但鉴于肝穿刺活组织检查的有创性以及目前尚无严格验证和审批上市的cccDNA检测试剂盒,肝组织内cccDNA检测无法在临床普遍开展[5]。因此,研究者们致力于寻找可替代cccDNA预测临床治愈终点的指标。
 
  HBV RNA作为新型血清学标志物还需大量研究证实,1996年德国学者K?ck[6]首次发现患者血清中还存在HBV RNA。近年来,我国和国外学者相继发现血清中的HBV RNA实质上可能是核衣壳内未经逆转录的前基因组(pregenomic RNA, pgRNA),释放到细胞外而入血的,其被称为"HBV RNA病毒样颗粒"[7,8]。血清中的HBV pgRNA仅能来自cccDNA,HBV RNA病毒样颗粒产生的过程不为核苷类药物治疗所阻断[7]。血清HBV RNA的水平成为反映患者肝细胞内cccDNA存在和转录活性的潜在指标。当血清中检测不到HBV RNA时,提示患者肝细胞内cccDNA的消失或处于转录静默状态[9]。
 
  本研究旨在分析107例经核苷类药物治疗后血清HBV DNA已降至低于检测下限的CHB患者中血清HBV RNA的水平,并探讨HBV RNA水平与患者肝脏生物化学指标丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)以及HBsAg、抗-HBe、抗-HBc之间的相关性。为新型血清学标志物HBV RNA的临床意义探究奠定研究基础。
 
  资料与方法
 
  1.研究对象:
 
  回顾性连续收集2017年12月至2018年4月在天津市第二人民医院就诊的慢性乙型肝炎患者资料,入组标准:(1)符合中国《慢性乙型肝炎防治指南》(2015年版)中的CHB诊断标准;(2)接受规范的核苷类药物抗病毒治疗12个月以上;(3)HBsAg阳性,抗-HBs阴性,HBeAg阴性,抗-HBe阳性,抗-HBc阳性;(4)连续6个月血清HBV DNA结果为低于检测下限。排除标准:同时有其他肝炎病毒感染、人类免疫缺陷病毒感染、酒精性肝炎、脂肪肝、肝硬化、肝衰竭、肝癌、自身免疫性肝病以及严重心、脑、肾病或神经系统疾病等。本研究通过本院伦理委员会审核[编号:津二人民伦审字(2018)16号]。
 
  2.临床观察指标:
 
  收集患者基线的人口学资料、临床资料,年龄、性别等一般资料;核苷类药物抗病毒治疗方案;HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc定量、HBV DNA载量等病毒学指标;肝功能生物化学指标(ALT、AST)、血常规、肾功能、血清肌酸激酶、乳酸等指标。HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc定量用美国雅培公司的ARCHITECTi2000SR仪器,应用化学发光法检测;HBV DNA病毒载量使用仪器为COBAS Ampliprep/COBAS TaqMan48,试剂采用COBAS Taqman HBV DNA载量检测试剂盒。
 
  3.实验室检测:
 
  本研究中检测的血清HBV RNA定量采用PerkinElmer公司的研发试剂:HBV pgRNA核酸检测试剂盒(荧光定量PCR法),检测原理主要通过核酸提取,DNase酶消化,反转录,PCR扩增等过程完成。本试剂设有严格的质控体系和防污染体系,有效地保障了实验结果的准确性。
 
  4.统计学方法:
 
  采用R Studio软件(R version 3.0.2)进行基本统计分析,获得性别、年龄、HBV病毒分型、HBsAg、抗-HBe、抗-HBc、ALT、AST等基本统计信息,制作HBsAg、抗-HBe、抗-HBc、ALT、AST分布小提琴图;使用vcd包,绘制多个类别型变量(性别、年龄组、HBV病毒亚型、HBV RNA检测阳性/阴性)马赛克图;使用vioplot包,绘制HBsAg、抗-HBe、抗-HBc、ALT、AST生物化学指标在HBV RNA阳性/阴性组箱型图;使用广义线性模型对一系列连续型(HBsAg、抗-HBe、抗-HBc、ALT、AST)和类别型(性别、年龄组、HBV病毒亚型)变量预测二值型(HBV RNA检测阳性/阴性)结果变量,并使用anova检验简化模型与原始模型差异。
 
  结果
 
  1.患者一般资料:
 
  共收集符合入组条件的CHB患者107例,年龄在26~83岁,男性患者64例,女性患者43例,HBV基因分型B型9例,C型98例。107例CHB患者年龄(50.01±13.17)岁,检测HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc、ALT、AST等指标以及HBV RNA病毒载量均采用同期HBV DNA病毒载量结果为低于检测下限的血样。入组患者具体情况见表1,相关指标分布情况用小提琴图表示(图1)。
 
  注:ALT:丙氨酸氨基转移酶;AST:天冬氨酸氨基转移酶
 
  图1 患者相关生物化学指标分布图
 
  2.HBV RNA检测结果:
 
  结合性别、年龄、HBV病毒亚型因素,分析入组患者血清中HBV RNA的检测结果。HBV RNA阳性患者24例,阳性率22.43%,阴性患者83例。根据HBV RNA的检测结果,将入组患者分为阳性组(P组)和阴性组(N组),综合性别、年龄组(a组:> 25岁~≤35岁;b组:> 35岁~≤45岁;c组:> 45岁~≤55岁;d组:> 55岁~≤65岁;e组:> 65岁)、HBV病毒分型多个类别型变量绘制HBV RNA检测分布马赛克图(图2),在HBV基因分型C型组中,男性HBV RNA阳性检测主要集中于> 35~≤45岁、> 45~≤55岁年龄组中,分别为4例(16.7%)、3例(12.5%),女性HBV RNA阳性检测主要集中于> 45~≤55岁年龄组中;在HBV基因分型B型组中,只有在男性> 25~≤35岁年龄组中存在1例HBV RNA阳性检测样本,其余检测样本结果均为HBV RNA阴性。
 
  注:N:HBV RNA阴性组;P:HBV RNA阳性组
 
  图2 患者HBV RNA检测分布马赛克图
 
  3.患者相关生物化学指标在HBV RNA阴性组/阳性组之间的比较:
 
  根据HBV RNA检测结果分为阴性组和阳性组,统计两组患者相关生物化学指标绘制箱型图(图3),HBV RNA阳性组患者中HBsAg、ALT、AST水平略高于HBV RNA阴性组;抗-HBc在HBV RNA阴性组中水平略高。抗-HBe在HBV RNA阴性组和阳性组中水平差异无统计学意义。绘制了患者相关生物化学指标之间的相关性,ALT与AST之间存在正相关性(r = 0.6),见图4。
 
  注:N:HBV RNA阴性组;P:HBV RNA阳性组;ALT:丙氨酸氨基转移酶;AST:天冬氨酸氨基转移酶
 
  图3 HBV RNA阴性/阳性两组患者相关生物化学指标箱型图
 
  注:ALT:丙氨酸氨基转移酶;AST:天冬氨酸氨基转移酶
 
  图4 患者相关生物化学指标相互关系图
 
  4.影响HBV RNA检测结果的多因素分析:
 
  结合性别、年龄、HBV基因分型、HBsAg、抗-HBe、抗-HBc、ALT、AST多因素进行logistic回归分析,见表2,结果显示抗-HBc是独立影响因素(P = 0.021)。
 
  讨论
 
  慢性HBV感染是引起肝硬化、肝癌的主要病因,也是目前全球主要关注的严重健康议题。理论上讲,长期服用核苷类药物治疗能够使肝内cccDNA最终被耗竭。然而,临床现实是即使是接受长期核苷类药物治疗的CHB患者,其HBsAg消失的比例仍然很低[10]。香港Lai等[11]研究发现在43例长时间接受核苷类药物治疗(平均治疗时间> 7年)的患者,有近半数肝组织内未检测到cccDNA,但却只有l例发生血清HBsAg阴转,这些患者的HBsAg多来自整合的病毒DNA片段。不同于血清HBsAg,血清中的HBV pgRNA仅能来自cccDNA。研究结果[12,13]揭示,血清HBV RNA能够很好地反映肝组织cccDNA的活性。这为通过检测血液中的pgRNA来间接反映患者肝组织内cccDNA的活性提供了可能。
 
  Gao等[14]研究发现经96周核苷类药物治疗,患者基线及治疗后血清HBV RNA下降水平与肝内cccDNA水平呈正相关。动物实验结果显示,经过核苷类药物治疗,血清HBV RNA水平不再反映肝组织内cccDNA的水平,但能够很好反映cccDNA的转录活性[15]。此外,Wang等[7]指出停药时HBV RNA水平也可预测停药后的病毒学反弹的发生,停药时未检出HBV RNA的患者发生病毒学反弹的风险较低,反之,患者发生病毒学反弹的风险较高。
 
  本研究主要通过建立恩替卡韦治疗的HBV DNA持续低于检测下限的"小三阳"CHB患者研究队列,探究血清中HBV RNA在研究队列中的阳性率为22.43%,进一步说明血清HBV RNA定量也有必要作为临床检测来反映患者肝组织内cccDNA的活动水平。本研究做了影响HBV RNA检测结果的多因素的logistic回归分析,显示抗-HBc是HBV RNA结果的独立影响因素。通过绘制箱型图显示HBV RNA阳性组患者中HBsAg、ALT、AST水平略高于HBV RNA阴性组;抗-HBc在HBV RNA阴性组中水平略高。但可能是受研究队列偏小的影响,这些差异均无统计学意义。
 
  尽管1996年就在慢性HBV感染者血清中发现HBV RNA的存在,但相关研究只是近几年才得以重视。血清HBV RNA水平有可能成为预测停药安全性的一个新的指标,但尚需进一步的深入研究证实。
 
  参考文献(略)
 
  (来源:中华肝脏病杂志)

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